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自新冠疫情爆发以来,疫苗研发一直是医药界最为关心的话题,其中mRNA疫苗因其研发和生产速度快更是被寄予厚望。mRNA疫苗是将外源目的基因序列通过转录、合成等工艺制备的mRNA通过特定的递送系统导入机体细胞并表达目的蛋白、刺激机体产生特异性免疫学反应,从而使机体获得免疫保护的一种核酸制剂。

 

mRNA疫苗进入体内如何发挥作用

通常情况下,mRNA疫苗通过胞吞作用以内含体的形式进入细胞质内,为了保证mRNA在翻译前保持完整,mRNA需要内含体与溶酶体结合前打破内含体包膜并逃离,释放出来的mRNA分子在细胞质里游动,直至游到核糖体,并在此翻译成肽链,最终折叠成蛋白质,这个外源蛋白称为抗原蛋白,它能刺激免疫系统,诱导针对该抗原的免疫反应,从而达到预防相关疾病的效果。

    抗原蛋白在蛋白酶体分解成较小的抗原片段,片段通过主要组织相容性复合体(MHC)类分子在细胞表面展示给细胞毒性T细胞(就是CD8+T细胞)。活化的细胞毒性T细胞通过分泌细胞分子,如穿孔素、颗粒酶等杀死感染细胞。此外,分泌的抗原可被细胞摄取,并通过MHC II类蛋白在细胞表面呈递给辅助性T细胞(就是CD4+T细胞),辅助性T细胞通过刺激B细胞产生抗体,并通过炎性细胞因子激活吞噬细胞,如巨噬细胞,实现病原体的清除,详见下图。

图片来源于网络

mRNA疫苗工业生产流程

生产阶段

细节描述

相关杂质

DNA原液的制备

构建含目的基因的载体、质粒扩增以及DNA的线性化;也可通过PCR扩增工艺获取

宿主菌DNA、宿主菌RNA、宿主蛋白残留、质粒DNA、DNA聚合酶内切酶

mRNA原液的制备

以线性DNA为模板,利用体外转录技术(IVT)制备mRNA,

此阶段制备的mRNA,包含5'端加帽结构(Cap)和3'polyA加尾结构

1产品相关杂质:mRNA功能的截短序列(可能来源于转录不完全或mRNA的降解/断裂)、可能导致非特异性免疫反应的双链mRNA序列、加帽不完全的mRNA、去磷酸不完全的mRNA、修饰过度的mRNA、双链RNA、RNA、残留模板DNA

2工艺相关杂质:帽子相关杂质、残留蛋白酶、RNA聚合酶、有机溶剂、金属离子残留、残留酶底物内毒素。

mRNA制剂生产

采用不同技术将mRNA与纳米递送材料通过自组装形成纳米粒子,经浓缩、纯化以及无菌过滤后进行灌装。LNP是mRNA疫苗递送的最佳选择之一

1)正电荷材料相关杂质,包括材料合成产生的杂质以及mRNA复合过程中可能产生的杂质;

2)不饱和脂质的氧化及相关降解产物;

3)纳米颗粒聚集产生的颗粒物;

4)未组装的脂质分子、阳离子物质;未包封的mRNA;在制剂及贮存过程中可能降解或失活的mRNA等。

 

mRNA疫苗质量保证体系

对mRNA序列进行设计和优化,是为了提高mRNA翻译效率、降低先天免疫原性增加稳定性,包括ORF区密码子、GC含量优化、修饰和序列改构帽子结构、转录启动子、5UTR和3UTR、Poly(A)长度设计、对所用核苷三磷酸(NTP)类型(如将尿嘧啶修饰改成1-甲基-假尿苷(1mΨ))及其修饰信息等进行设计。这些工艺环节不可避免的会产生残留引入杂质。mRNA疫苗产品的杂质类型大致可分为mRNA相关杂质、DNA残留、蛋白质残留、递送物质相关杂质、颗粒相关杂质及生产工艺相关杂质等。对主要杂质进行监测与分析,至关重要的。

图片来源于网络

 

鉴于目前mRNA疫苗技术还不够成熟,新型冠状病毒预防用mRNA疫苗药学研究技术指导原则(试行)中,建议考虑质控项目:mRNA鉴别、mRNA序列长度、序列完整性及准确性、mRNA理化特性(如pH、外观等)、mRNA含量、加帽率、纯度、产品相关杂质(如不完整mRNA、双链RNA等)、工艺相关杂质(如残留蛋白酶、DNA模板残留、有机溶剂、金属离子残留等)、无菌、内毒素等。

 

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SCICONS产品信息

品牌

货号

英文品名

中文品名

规格

SCICONS

10010200

Mouse anti double-stranded RNA (J2)

小鼠抗双链RNA单克隆抗体 (J2)

200g

SCICONS

10010500

Mouse anti double-stranded RNA (J2)

小鼠抗双链RNA单克隆抗体 (J2)

500g

SCICONS

10040200

Mouse anti double-stranded RNA (J5)

小鼠抗双链RNA单克隆抗体 (J5)

200g

SCICONS

10040500

Mouse anti double-stranded RNA (J5)

小鼠抗双链RNA单克隆抗体 (J5)

500g

SCICONS

10020200

Mouse anti double-stranded RNA (K1)

小鼠抗双链RNA单克隆抗体 (K1)

200g

SCICONS

10020500

Mouse anti double-stranded RNA (K1)

小鼠抗双链RNA单克隆抗体 (K1)

500g

SCICONS

10050100

Mouse anti double-stranded RNA (J2, J5 and K1) Comparison Kit

小鼠抗双链RNA单克隆抗体(J2,J5 and K1)组合试剂

3 x 100 ?g

SCICONS

10613002

Double-stranded RNA (dsRNA) ELISA kit (J2 based)

双链RNA (dsRNA) ELISA试剂盒(J2)

Kit

SCICONS

10623002

Double-stranded RNA (dsRNA) ELISA kit (K1 based)

双链RNA (dsRNA) ELISA试剂盒(K1)

Kit

SCICONS

10623005

Double-stranded RNA (dsRNA) ELISA kit (K1 based)

双链RNA (dsRNA) ELISA试剂盒(K1)

Kit

SCICONS

10613005

Double-stranded RNA (dsRNA) ELISA kit (J2 based)

双链RNA (dsRNA) ELISA试剂盒(J2)

Kit

SCICONS

10030010

Mouse anti double-stranded RNA (K2)

小鼠抗双链RNA单克隆抗体 (K2)(干冰运输)

10ml

SCICONS

10030005

Mouse anti double-stranded RNA (K2)

小鼠抗双链RNA单克隆抗体 (K2)(干冰运输)

5ml



 

SCICONS总部位于匈牙利的锡兹拉库(Szirák),是一家提供与双链RNA分子杂交的小鼠单克隆抗体的厂家,SCICONS1990年就开始利用杂交瘤细胞系生产抗双链RNAanti-dsRNA)的单克隆抗体,客户遍布世界很多国家和地区,在美国有超过一半的州都在使用SCICONS的单克隆抗体,客户包括众多研究机构的学者,发表的文章超过200多篇。SCICONS2021413日被Nordic-MUbio BV收购。

 

参考文献:

  1. 新型冠状病毒预防用mRNA疫苗药学研究技术指导原则(试行)
  2. Sch?nborn, J., Oberstrass, J., Breyel, E., Tittgen, J., Schumacher, J. and Lukacs, N. (1991) Monoclonal antibodies to double-stranded RNA as probes of RNA structure in crude nucleic acid extracts. Nucleic Acids Res.19, 2993-3000
  3. K. Karikó, H. Muramatsu, J. Ludwig, D. Weissman, Generating the optimal mRNA for therapy: HPLC purification eliminates immune activation and improves translation of nucleoside-modified, protein-encoding mRNA, Nucleic Acids Research (2011) 39(21); e142, https://doi.org/10.1093/nar/gkr695.
  4. Lukacs, N. (1997) Detection of sense:antisense duplexes by structurespecific anti-RNA antibodies. In: Antisense Technology. A Practical Approach, C. Lichtenstein and W. Nellen (eds), pp. 281-295. IRL Press, Oxford.
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